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石金钱龟多肽体外抗肿瘤活性初步研究

2017/4/11 11:11:57      点击:
(1 暨南大学药学院 中药及天然药物研究所 广州 510632


2 暨南大学理工学院 食品科学与工程系 广州 510632


3 深圳凯联健康科技有限公司 深圳 518000)


  摘要:探讨由石金钱龟制得的一组水溶性多肽(简称石金钱龟多肽)的抗肿瘤作用。以6.25,12.5,25,50,100,200,400 mg/mL的石金钱龟多肽处理MDA-MB-231等10种肿瘤细胞以测定其细胞增殖抑制活性,并对石金钱龟多肽较敏感的细胞株进行周期变化的研究以初步探讨其抗肿瘤机制。石金钱龟多肽在25-400 mg·mL-1内,对MDA-MB-231细胞的增殖具有明显的抑制作用,对乳腺瘤细胞的周期具有一定的阻滞作用。石金钱龟多肽体外对不同肿瘤细胞的抑制效果不同,对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7细胞具有显著的抑制作用。


关键词:石金钱龟;多肽;抗肿瘤


  由于肿瘤细胞有其特殊的生长模式,如无限复制、可以对生长信号进行自我调节,对外界生长抑制信号敏感性较差,以及具有极强的抗细胞凋亡能力,可以自主调控供给营养血管的生成和免疫逃逸等特性,使一般的抗肿瘤药物很难达到较好的杀死肿瘤细胞的功效[1]。而肽类对肿瘤具有较好的亲和力和较强的特异性以及以肽为基础的治疗,与其它小分子化学药物及抗体相比,由于他们体积微小,因此更容易渗透到组织中,再者就是多肽类具有低毒性等优点,还可以增加对肿瘤治疗的敏感度,因此成为近年来抗肿瘤治疗新型抗癌方法研究的热点之一[2]。虽然多肽类化合物具有一定的活性,尤其是在抗肿瘤方面,但2015版药典收录的多肽药物仅有20多种,且皆是国外的已过专利保护期或未在我国申请专利的药物,而抗肿瘤肽仅有一种(醋酸奥曲肽),因此开发出具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物也成为多肽研发的一个热点[3]。


  因此我们希望在极少得肿瘤的动物中获得某些有抗肿瘤活性的多肽并对其抗肿瘤活性及其机理进行研究,以期开发出具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物,以下是我们研究石金钱龟多肽的抗肿瘤实验。




01材料与方法
1.1 主要材料与试剂


  石金钱龟多肽:10 g肉糜,按1:5-10的比例加入超纯水,温度控制在40-50℃左右,pH范围为7-8,加入一定量的中性蛋白酶,在酶解过程中用NaOH调节反应体系的pH值,水解10 h后,85℃灭酶10 min,8000 r/min 离心30 min除去沉淀,冷冻干燥得到粗蛋白。对粗蛋白进行进一步分离得分子量为2000-3000的多肽混合物[4]。


  肿瘤细胞:MDA-MB-231,Hela,SGC-7901,COLO-320,MCF-7,Hep-G2,PC-3,K562,A-375,A-549(购买于中国科学学院上海细胞库)。


1.2 主要仪器


  BSA124S型电子天平:德国Sartorius AG 公司;SSW 型微电脑电热恒温槽:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Forma 3111型CO2培养箱:美国Thermo公司;酶标仪:美国Bio-Rad公司。


1.3 试验方法


1.3.1 细胞培养


  将实验所用的各种肿瘤细胞(购自中科院上海细胞库)按其生存生长条件进行培养,培养箱中培养至对数生长期备用。


1.3.2 细胞增殖抑制率的测定
  
  取对数生长期的细胞制成悬液,接种至96孔板,每孔200 μL,于5% CO2,37 ℃培养24 h,然后分别加入不同浓度的多肽溶液,每个浓度设3个平行孔,同时设加PBS的对照组,置5% CO2,37 ℃培养箱中孵育,培养结束后,加PBS洗2遍,然后加MTT继续培养4 h,洗去MTT,加DMSO充分震荡后置酶联免疫检测仪在490 nm测吸光度,计算细胞增殖抑制率[5]。


1.3.3石金钱龟多肽液对肿瘤细胞周期的影响


  取对数生长期的MCF-7,MDA-MB-231肿瘤细胞制成细胞悬液(1×106个/ml),加入24孔培养板中培养,24 h后加入不同稀释度的石金钱龟多肽,每个浓度设3个复孔,再继续培养24 h。用PBS液洗2次,用预冷的75 %乙醇固定,加入碘化丙啶,置4℃避光染色50 min,过400目尼龙网,用流式细胞仪测定细胞的周期分布[5]。




02结果与分析


2.1 石金钱龟多肽的抗肿瘤活性


  采用MTT法检测石金钱龟多肽对MDA-MB-231,Hela,SGC-7901,COLO-320,MCF-7,Hep-G2,PC-3,K562,A-375,A-549等肿瘤细胞作用24h后的增殖抑制率,结果见表1。石金钱龟多肽对乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞具有较好的增殖抑制效果,当浓度为25 mg/mL时,对MDA-MB-231及MC-7的抑制率分别为62.07 %和70.37 %;对Hela及COLO-320细胞抑制活性较差,浓度为400 mg/mL 时,抑制率仅为48.10 %及46.04 %;且石金钱龟多肽对MDA-MB-231、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K562等的抑制活性呈现浓度依赖性,实验中当石金钱龟多肽的浓度为1、2 mg/mL时,对10种细胞均没有增殖抑制效果。




▼表1 不同浓度石金钱龟多肽对10 种肿瘤细胞的增殖抑制率








2.2石金钱龟多肽液对肿瘤细胞周期的影响


  用流式细胞仪分别观察石金钱龟多肽液对MDA-MB-231及MCF-7肿瘤细胞作用24 h后,各组细胞周期的变化,发现石金钱龟多肽液对MDA-MB-231细胞发生G2-M期阻滞,而MCF-7细胞发生S期阻滞。




03讨 论


  本实验研究了石金钱龟多肽对10 种肿瘤细胞的增殖抑制活性,结果表明,石金钱龟多肽对乳腺癌细胞系的MDA-MB-231和MCF-7细胞表现出了很强的细胞增殖抑制活性,而对Hela,COLO-320肿瘤细胞没有显著活性对。对MDA-MB-231,SGC-7901,Hep-G2,PC-3,K562,A-375,A-549等细胞具有较好的抑制活性,在多肽浓度达到400 mg/mL时抑制率均达到68%以上。实验发现石金钱龟多肽对MDA-MB-231及MCF-7肿瘤细胞的细胞周期有一定的影响,对MDA-MB-231细胞的G2-M期发生阻滞,而对MCF-7细胞发生S期阻滞。


  在肿瘤治疗的研究中,科学家们发现肽类作为抗肿瘤药物具有很大的开发前景,抗肿瘤肽近年来受到国内外医药领域的广泛关注,已有较多的抗肿瘤肽的研究已经进入到临床前或临床试验阶段,并且显示出巨大的药物应用价值[6-7]。多肽作为药物具有独力特的优势:分子量小,无免疫原性,组织渗透性好;亲和高,副作用小等优点。活性多肽由于具有敏感性高、稳定性好及副作用少等优点,已被用作抗肿瘤药物开发的一个重要来源。






参考文献:
 
  [1] Oyston P C, Fox M A, Richards S J, et al. Novel peptide therapeutics for treatment of infections. [J]. J Med Microbiol, 2009, 58(Pt 8): 977-987.


  [2] ZHANG X W, HUANG Z Q, LIC C. Antitumor activity of thevetoside alone and in combination with chlormethine in vivo. [J]. Acta Pharmacol Sin, 1994, 15 (3): 285-288.


  [3] 李书国, 陈辉, 杜进民, 等. 大豆多肽的功能特性及加工工艺. [J]. 粮油食品科技, 2000(1): 14-15.


  [4] 赵志淮, 冯志彪. 蛋白质水解物水解度的测定. [J]. 食品科学, 1994 (11): 65-67.


  [5] BHUTIA S K, MAITI T K. Targeting tumors with peptides from natural sources. [J]. Cell, 2008, 26(4): 210-217.


  [6] 程仕伟, 于晓明, 张玉香. 紫贻贝多糖提取及其体外抗氧化活性研究. [J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 132-134.


  [7] LEE Y G, LEE K W, KIM J Y, et al. Induction of apoptosis in a human lymphoma cell line by hydrophobic peptide fraction separated from anchovy sauce. [J]. BioFactors, 2004, 21: 63-67.